［文献解读］利用NGS技术研究早期肺癌肿瘤及循环DNA的克隆与遗传变化

Targeted sequencing reveals clonal genetic changes in the progression of early lung neoplasms and paired circulating DNA
NATURE COMMUNICATIONS IF: 11.329

背景
1.肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，故亦称支气管肺癌。肺癌中最多见的类型为鳞癌与腺癌。不论中国或北美,肺腺癌发病率均见上升,已列各类型首位。
2.世界卫生组织(WHO)提出,肺腺癌的前期病变为不典型腺瘤样增生(AAH),目前无论是病理还是临床,对AAH的认识均有不足。
3.研究不典型腺瘤样增生(AAH)与原位肺腺癌(AIS)及微浸润性肺腺癌(MIA)的克隆及遗传变化，具有重要意义。
摘要
该研究为回顾性研究，利用NGS技术对于6例不典型腺瘤样增生(AAH)、5例原位肺腺癌(AIS)及5例微浸润性肺腺癌(MIA)患者的多位点组织样本进行检测分析。检测结果显示同一肿瘤患者的不同位置组织样本含有不同的驱动基因突变，说明克隆扩张在肿瘤发生时已经出现。该研究发现KRAS, TP53 和EGFR突变是肺腺癌恶性转变的一个指标。通过ddPCR技术在早期腺瘤的循环DNA中检出突变。该研究揭示了早期肺腺癌进化的克隆现象，这种现象在肿瘤获得侵袭性和恶化前检测到。
研究目的
1.通过AAH、AIS、MIA样本突变图谱分析，研究早期肺腺癌的遗传变化
2.AAH、AIS、MIA遗传变化的比较分析，研究肺腺癌的克隆进化过程
3.AIS和MIA多位点比较分析，研究早期肺腺癌(ASI和MIA)的肿瘤异质性
4.血清及血浆检测分析，研究ctDNA在早期肺腺癌中的应用
入组患者及标本

1.6例伴随有AAH的肺腺癌患者
3-5个AAH样本
原发灶组织标本
2.5例AIS患者
3个组织样本
3.5例MIA患者
４个组织样本
AAH 突变频谱

对象：6例肺腺癌患者的25个AAH样本
结果： 共检出56个非同义突变，每个样本平均含有2.2个突变（Range: 0-6），其中BRAF和ARID1B基因突变率为16%，MAML1和EGFR基因突变率为12%, ABL、ATM、MED12、RET、ROS1基因突变率为８%。
MIA 突变频谱

对象：5例MIA患者20个样本
结果：共检出54个非同义突变，每例患者平均含有10.8个突变。EGFR和TP53是发生频率最高的2个突变, 患者检出数目分别为４和３; ATRX、CTNNB1、 MED12均在２例患者检出。
AIS 突变频谱

对象：5例AIS患者15个样本
结果：共检出31个非同义突变，每例患者平均含有6.2个突变. 只有ARID1A基因在２例患者同时检测到，EGFR和TP53均在１例患者检出，１例患者含有NOTCH1基因扩增。
肿瘤克隆进化分析

方法：利用Cytoscape生物信息学工具对蛋白质相互作用关系进行分析，构建蛋白质互作图
结果：AAH突变基因在蛋白质互作图之外的数目最多(13个)，AIS和MIA样本均有6个突变基因在蛋白质互作图之外
结论：癌前病变组织具有突变多样性，可能影响癌症发生相关的信号通路。
肿瘤克隆进化分析

方法：AAH、AIS、MIA突变基因进行聚类分析，并对三种类型样本的突变，根据突变丰度进行聚类
结果：AAH、AIS、MIA共有突变基因为EGFR、TP53、IGF1R，其中EGFR和TP53在MIA中突变丰度最高，均高于20%。
结论：EGFR和TP53突变是肿瘤恶化转变的驱动突变
肿瘤克隆进化分析

6个伴随有AAH患者的原发灶样本中，只有1个检出BRAF突变，该6例患者的AAH样本，4例患者检出BRAF突变。75%的AAH检出BRAF突变患者中，其原发灶为BRAF野生型，说明BRAF突变不是肿瘤发生的驱动突变。
Patien1 1-7337患者检出EGFR deletion, TP53 p.279G4E, Patient 3-9911患者检出KRAS p.12G4C突变，且这些突变的丰度在原发灶中均升高，说明EGFR、TP53、KRAS突变是肿瘤发生的驱动突变
早期肺腺癌的肿瘤异质性

肿瘤异质性在原位肺腺癌(AIS)和微浸润肺腺癌(MIA)中均存在。
患者各样本共有的突变为肿瘤驱动基因，例如EGFR, TP53, KRAS ,ATRX等
液体活检技术应用

对象：１例来自AAH研究组中的患者(2AAH)和１例来自MIA研究组的患者(3MIA)的血浆及血清样本
结果：组织样本NGS检出的14个突变使用ddPCR均可以检出; 肿瘤样本存在的13个突变中，血浆检出10个，血清检出7个; 对于3MIA患者，血浆中检出的IGF1R, MED12, TP53，CCND1突变，都只在某一个肿瘤样本中检出，说明血浆检测一定程度克服肿瘤异质性的影响 。血浆中检出的突变丰度与组织无相关性。
结论
1. KRAS, TP53 和 EGFR在AAH以及对应的肿瘤组织均检出，且肿瘤组织中的突变丰度教AAH高，三个突变与肺腺癌的转移恶化相关。
2. AIS和MIA患者不同位置样本检测，各样本存在特有突变位点，说明早期肺腺癌(AIS和MIA)存在肿瘤异质性。
3. 血浆样本检测到大部分肿瘤组织存在的突变，且包含不在同一患者各位置样本检出突变，说明血浆检测可以应用于早期肺腺癌检测，且血浆检测一定程度克服肿瘤异质性对于检测的影响。

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